細(xì)胞色素P450酶系體外藥物代謝研究方法進展

來源：中國藥事2013年第27卷第1期

作者：于敏，張雙慶，聞鎳，李佐剛

中國食品藥品檢定研究院食品藥品安全評價研究所

摘要

目的：綜述細(xì)胞色素P450（CYP450）酶影響藥物代謝的體外研究方法。

方法：參考國內(nèi)外文獻，對與藥物代謝相關(guān)的CYP酶亞型、CYP酶種屬差異、CYP酶體外反應(yīng)體系、藥物主要代謝酶的確認(rèn)方法及體外CYP酶的抑制和誘導(dǎo)，進行分類、歸納和整理。

結(jié)果與結(jié)論：CYP450在藥物代謝中具有重要作用，藥物代謝研究是新藥評價體系中重要的一部分。

關(guān)鍵詞

細(xì)胞色素P450酶；藥物代謝；藥物相互作用；體外研究

藥物進入機體后主要以兩種方式被清除：一種是藥物不經(jīng)任何代謝而直接以原型形式排出體外；另一種是部分藥物在體內(nèi)經(jīng)代謝后，再以原型和代謝物的形式排出體外。當(dāng)藥物主要通過代謝被清除時，代謝途徑可顯著影響藥物的安全性、療效及用法。

藥物的代謝，也稱為生物轉(zhuǎn)化，在體內(nèi)主要有兩個步驟：第1步稱為Ⅰ相代謝反應(yīng)，藥物在這相反應(yīng)中被氧化、還原或水解；催化Ⅰ相反應(yīng)的酶主要為肝微粒體中的細(xì)胞色素P450酶（CytochromeP450，CYP450）。

第二步稱為Ⅱ相代謝反應(yīng)，藥物在這一相反應(yīng)中與一些內(nèi)源性的物質(zhì)（如葡萄糖醛酸、甘氨酸、硫酸等）結(jié)合或經(jīng)甲基化、乙酰化后排出體外；催化Ⅱ相反應(yīng)的酶有許多，其中主要的有葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶和乙?；D(zhuǎn)移酶等。

在上述的代謝反應(yīng)中，由P450酶所催化的Ⅰ相反應(yīng)是藥物在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵性步驟，因為這一步反應(yīng)常常是藥物從體內(nèi)被清除的限速步驟，它可以影響到藥物許多重要的藥動學(xué)特性，如藥物的半衰期、清除率和生物利用度等［１］；此外，若藥物通過單個代謝途徑被清除，則代謝速率的個體差異可導(dǎo)致血液和組織中的藥物和代謝產(chǎn)物濃度出現(xiàn)巨大差異。

1細(xì)胞色素P450酶

細(xì)胞色素P450酶，是一種以鐵卟啉為輔基的蛋白質(zhì)，不僅分布于肝臟，小腸和腎臟也有表達，由血紅素蛋白（P450）、黃素蛋白（NADPH－細(xì)胞色素Ｃ還原酶）及磷脂三部分組成，相對分子質(zhì)量為45000～55000Da。P450酶系由Ｋｌｉｎｇｂｅｒｇ和Ｇｏｒｆｉｎｋｌｅ在1958年發(fā)現(xiàn)的，由于它在還原狀態(tài)下可以與CO結(jié)合，并在波長為450ｎｍ 時有大吸收峰，因此而得名［２］。該酶有許多同工酶，故稱細(xì)胞色素P450酶系，簡稱為CYP450S。CYP450S的命名方法：第1個數(shù)字表示族，第二個英文字母表示亞族，第三個數(shù)字表示某種特定的酶， 如CYP2D6［３］。

CYP450S的分類：CYP450S是一組由許多同工酶組成的超基因大家庭，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和人類基因組計劃的完成，人類編碼CYP450S的基因已基本明確，由18個基因家族，43個亞家族，57個基因，59個假基因組成。

在人類肝臟各種代謝酶中，CYP3A4、CYP2C、CYP1A2和CYP2E1分別占29%，17%，１2% 和6%，CYP2A6 占4%，CYP2D6占1%［４］。雖然有18個基因家族，但是大約95%的藥物氧化作用由６種CYP酶催化執(zhí)行，其中CYP3A4占３５％，CYP2D6占１５％，CYP1A2占１２％，CYP2C9占９％，CYP2C19占８％，CYP2B6和CYP2E1均占６％，CYP2A6占３％［５］。

該酶系具有以下幾方面的生物學(xué)特性：

（１）P450酶是一個多功能的酶系，可以催化60種以上的代謝反應(yīng)，它可作為單加氧酶、脫氫酶、還原酶、過氧化酶、酯酶等而催化代謝反應(yīng)，因此P450酶可以催化一種底物同時產(chǎn)生幾種不同的代謝物；

（２）P450酶對底物結(jié)構(gòu)的特異性不強，可代謝各種類型化學(xué)結(jié)構(gòu)的底物，每一種P450酶都有廣泛的底物，既能代謝大分子底物，也能代謝小分子的底物；

（３）P450酶存在有明顯的種屬、性別和年齡差異。

其中以種屬差異表現(xiàn)-為明顯，不同種屬的P450同工酶組成不同，因此藥物在不同種屬動物和人體內(nèi)的代謝途徑及代謝產(chǎn)物可能不同。這是由于P450在不同種屬中基因表達上的差異所造成的，P450酶在不同種屬的動物和人體內(nèi)的表達有質(zhì)和量的差異，因此不同種屬動物和人體內(nèi)的P450酶底物和產(chǎn)物特異性及P450酶活性可以不同。這是造成代謝種屬差異的主要原因，因此我們不能*用動物P450酶來代替人的P450酶進行研究，具體的CYP酶亞型見表１。

P450酶的性別差異在大鼠體內(nèi)表現(xiàn)-為明顯，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)雌雄大鼠體內(nèi)P450同工酶的組成有明顯的質(zhì)和量的差異，某些藥物在雌、雄大鼠體內(nèi)的主要代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能是不同的，因而造成其在雌雄大鼠體內(nèi)的毒性也存在明顯的差異，這值得引起臨床前藥動學(xué)和毒理學(xué)研究的重視。

P450酶在年齡上的差異主要表現(xiàn)在酶量和活性方面［６］；

（４）P450酶具有多型性，它是一個*家族，每種哺乳動物至少有３０種以上的P450酶，由此可見P450酶系是由多種類型的P450酶所組成的一個龐大家族；

（５）P450 酶具有多態(tài)性（PｏｌｙｍｏｒPｈｉｓｍ），即同一種屬的不同個體間某些P450酶的活性存在較大差異，可將個體按代謝速度的快慢分為四種表型：弱代謝型（PＭｓ）是缺乏功能酶，中等代謝型（ＩＭｓ）是等位基因缺失雜合子，強代謝型（ＥＭｓ）是攜帶兩個功能基因拷貝，和*代謝型（ＵＭｓ）是攜帶兩個以上功能基因拷貝。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在人肝P450 酶中，CYP1A1-3、CYP2C8-9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A3-4均表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性，其中以CYP2D6和CYP2C19的多態(tài)性-為典型，如由CYP2C19參與的S-美芬妥因的羥化代謝就表現(xiàn)出典型的多態(tài)性，即不同個體對S-美芬妥因的羥化代謝速度存在非常顯著的差異，按代謝速度可以將人群分為兩種類型，即PＭｓ 和ＥＭｓ，前者的血藥濃度明顯高于后者，PＭｓ的ＡＵＣ值（藥－時曲線下面積）顯著升高，消除半衰期明顯延長。

P450酶的多態(tài)性主要是由于其基因缺陷所致，這種基因缺陷可能是由于遺傳變異所造成的。

P450酶的多態(tài)性不僅表現(xiàn)在同一種屬的不同個體間，同時不同種族間的代謝缺陷發(fā)生率也存在顯著差異，如CYP2D6在不同種族中的PＭｓ的發(fā)生率就存在明顯的種族差異，黃種人對異喹胍的代謝缺陷（即PＭｓ）發(fā)生率為１％左右，黑人的代謝缺陷發(fā)生率為０％～２％，而白種人的代謝缺陷發(fā)生率高達５％～１０％［７］。

（６）P450酶具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。

一方面包括藥物在內(nèi)的很多化學(xué)異物可對P450酶產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，使某些P450酶的量和活性明顯增加。

人們較早發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象，其中典型的例子就是苯-巴比妥可以誘導(dǎo)肝P450酶，從而加速其自身的代謝，使其鎮(zhèn)靜、催眠作用減弱。

另一方面，許多外源性的化學(xué)異物包括許多藥物可以選擇性地抑制某些P450酶，使其活性明顯降低，因而可以抑制其對其他化學(xué)異物的代謝［８］。

2細(xì)胞色素P450酶系藥物代謝研究方法

2.1 所需材料和儀器

受試藥物，混合肝微粒體，磷酸鉀緩沖液（PＨ７．４，５０～１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１），NADPH再生系統(tǒng)（匯智泰康NADPH再生系統(tǒng)，包括Solution A和SolutionB兩種試劑，臨用混合，Ａ試劑含有３１ｍＭＮＡＤP＋、６６ｍＭＧ－６－P和６６ｍＭＭｇＣｌ２，Ｂ試劑含有４０Ｕ·ｍＬ－１Ｇ－６－PＤＨ，其再生原理為Ｇ－６－PＤＨ 催化Ｇ－６－P脫氫，并將ＮＡＤP＋轉(zhuǎn)化為ＮＡＤPＨ，其中Ｍｇ２＋ 是Ｇ－６－PＤＨ 催化反應(yīng)所必需的輔助因子）或者市售的NADPH 和ＭｇＣｌ２，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，離心機，３７°Ｃ水浴搖床，超低溫冰箱。

2.2 所需溶液的配制

反應(yīng)緩沖液（50mmol· L-1PH7.4匯智泰-康磷酸鹽緩沖液），反應(yīng)啟動液（Solution A和SolutionB臨用前４°Ｃ過夜解凍，置冰浴中，按５∶１ （ｖ／ｖ）混合，再加入反應(yīng)緩沖液稀釋至ＮＡＤP＋含量約為１ｍｍｏｌ·Ｌ－１后使用）／ （１ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＮＡＤPＨ 溶液和５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２），反應(yīng)終止液（冰冷的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液，－２０°Ｃ儲存，加入３倍體積終止反應(yīng)），肝微粒體（匯-智泰康可提供猴肝微粒體，大鼠肝微粒體，小鼠肝微粒體等）溶液（－７０°Ｃ取出后３７°Ｃ水?。保恚椋羁焖俳鈨?，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中用反應(yīng)緩沖液稀釋至０．２ｍｇ·ｍＬ－１，不可反復(fù)凍融），受試藥物儲備液及工作液，內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 建立反應(yīng)體系

（１）NADPH溶液、微粒體溶液、受試藥物工作液和反應(yīng)緩沖液放入３７°Ｃ水浴中，５０ｒPｍ下恒溫５ｍｉｎ；（２）取不同摩爾濃度的受試藥物工作液１５０μＬ，加入０．２ｍｇ·ｍＬ－１的微粒體溶液６０μＬ，不建議渦旋混勻，加入反應(yīng)啟動液ＮＡＤPＨ 再生系統(tǒng)９０μＬ混勻后開始計時；（３）分別于孵育不同時間取出２０μＬ孵育液，轉(zhuǎn)移到冰浴上，加入３倍體積反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，渦旋，離心，取上清液１０μＬＬＣ－ＭＳ／ＭＳ進樣分析［９］；（４）根據(jù)實驗結(jié)果，優(yōu)化孵育時間、底物濃度、微粒體蛋白濃度。

2.4 反應(yīng)體系注意事項

２．４反應(yīng)體系注意事項

（１）體外孵育條件：緩沖體系的選擇，緩沖體系的離子強度，孵育環(huán)境PＨ 值，孵育時間和微粒體蛋白濃度都會影響酶促反應(yīng)的代謝速度。

底物濃度應(yīng)當(dāng)過量，大于酶適底物濃度約１０倍，且反應(yīng)消耗量應(yīng)當(dāng)＜２０％。

（２）有機溶劑的影響：由于許多P450酶底物和抑制劑都是強疏水性化合物，建立水性反應(yīng)體系時，不可避免會用到甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亞砜（DMSO）等有機溶劑。

但是，有機溶劑會影響天然酶反應(yīng)環(huán)境和酶活性，從而改變酶－底物相互作用，因此，有機溶劑的濃度要求＜１％ （ｖ／ｖ），-好＜０．１％。

（３）非特異性微粒體結(jié)合：因為大部分藥物都是脂溶性有機化合物，會與微粒體膜上的脂質(zhì)蛋白產(chǎn)生非特異性結(jié)合，使得游離的底物濃度小于添加濃度。

會出現(xiàn)基于添加濃度的表觀Ｋｍ值（米氏常數(shù)，即藥物在體內(nèi)的消除速度為Ｖｍ的一半時所對應(yīng)的血藥濃度）高于真實Ｋｍ，但其不影響Ｖｍａｘ值，導(dǎo)致高估了Ｋｍ值而低估了體內(nèi)藥物清除率（ＣＬ）。

因此，應(yīng)當(dāng)優(yōu)化微粒體蛋白濃度，選用可定量代謝物的低蛋白濃度，使非特異性蛋白結(jié)合小化。

2.5 數(shù)據(jù)分析

2.5.1 典型酶促動力學(xué)

典型的CYP介導(dǎo)的酶促反應(yīng)動力學(xué)符合米氏方程（公式１）特征，擬合動力學(xué)曲線，計算酶促動力學(xué)參數(shù)Ｖｍａｘ和Ｋｍ，其中ｖ 是反應(yīng)速度， ［Ｓ］是底物濃度，Ｖｍａｘ是大反應(yīng)速度，Ｋｍ是米氏常數(shù)———表示達到大反應(yīng)速度一半時的底物濃度。

從反應(yīng)式１得出Ｋｍ是反映速度的常數(shù)，Ｋｍ＝ ｋ－１＋ｋ２／ｋ１。

有報道稱Ｋｍ是反映底物對酶的親和性，此說法是不正確的［１０］。

因ｖ＝ＣＬｉｎｔ· ［Ｓ］，將米氏方程轉(zhuǎn)換得到公式２，通過Ｖｍａｘ和Ｋｍ值可以計算得到藥物的體外固有清除率，將體外清除率（ＣＬｉｎｔ）外推得到該藥物的體內(nèi)ＣＬｉｎｔ。

2.5.2 動力學(xué)曲線

通過擬合動力學(xué)曲線，可以快速求出參數(shù)值，而且可以初步判斷有無酶抑制現(xiàn)象或者是否是非典型酶促動力學(xué)。

2.5.2.1 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ 作圖

以１／ｖ為ｙ軸，１／ ［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線，直線的斜率即Ｋｍ／ｖ，ｙ軸截距是１／Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是－１／Ｋｍ。

此作圖方法是常用的計算酶促動力學(xué)參數(shù)的方法，但其會夸大底物濃度低時的錯誤，故常用于初期參數(shù)評價，而不常用于終參數(shù)確定。

2.5.2.2 Ｈａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆ 作圖

以［Ｓ］／ｖ為ｙ軸，［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線，直線的斜率即１／Ｖｍａｘ，ｙ軸截距是Ｋｍ／Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是－Ｋｍ。

與前種方法比較，此作圖方法錯誤概率小且恒定，是確定酶促動力學(xué)參數(shù)更好的選擇。

2.5.2.3 Ｅａｄｉｅ－Ｈｏｆｓｔｅｅ 作圖

以ｖ為ｙ軸，ｖ／ ［Ｓ］為ｘ軸作圖，得到一條直線，直線的斜率即－Ｋｍ，ｙ軸截距是Ｖｍａｘ，ｘ軸截距是Ｖｍａｘ／Ｋｍ。

此作圖方法因ｘ軸是速度，是一個變量，會引入更多的實驗誤差。值得關(guān)注的是，根據(jù)此作圖方法擬合曲線的形狀可以判斷非典型酶促動力學(xué)的類型。

2.5.3 非典型酶促動力學(xué)

大部分CYP酶介導(dǎo)的藥物代謝反應(yīng)符合典型酶促動力學(xué)的雙曲線模型，但是一些P450酶會呈非典型酶促動力學(xué)，是由于酶和底物分子具有多個結(jié)合位點造成動力學(xué)行為的改變。

非典型酶促動力學(xué)有四種模型：反曲線同向協(xié)同（ＨｏｍｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ：ＳｉｇｍｏｉｄａｌＫｉｎｅｔｉｃｓ），二段式同向協(xié)同（ＨｏｍｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ：ＢｉPｈａｓｉｃＫｉｎｅｔｉｃｓ），底物抑制動力學(xué)和異向協(xié)同（ＨｅｔｅｒｏｔｒｏPｉｃＣｏｏPｅｒａｔｉｖｉｔｙ）。

同向協(xié)同是兩個相同的底物分子協(xié)同作用的結(jié)果，異向協(xié)同是兩個結(jié)構(gòu)上*不同的底物分子協(xié)同作用的結(jié)果。

2.5.4 酶抑制動力學(xué)

此效應(yīng)是緣于抑制劑效應(yīng)分子的存在，使得酶被抑制，底物反應(yīng)速度下降。

通過體外酶抑制動力學(xué)可以預(yù)測可能存在的藥物－藥物相互作用。

其中對酶的抑制作用按機理分為可逆性，半可逆性和不可逆性三類。

不可逆性抑制是抑制劑（也可稱滅活劑Ｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ）和酶形成的結(jié)合物被酶激活后不可逆地使酶失去活性，其呈現(xiàn)時間依賴性，往往抑制劑從體內(nèi)清除后其抑制作用還會存在一段時間。

可逆性抑制（ＲｅｖｅｒｓｉｂｌｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）包括三種：競爭性抑制（ＣｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），非競爭性抑制（ＮｏｎｃｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ） 和反競爭性抑制（ＵｎｃｏｍPｅｔｉｔｉｖｅＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）。

競爭性抑制是簡單常見的類型，是抑制劑與底物競爭游離酶的結(jié)合部位，對反應(yīng)的Ｖｍａｘ不產(chǎn)生影響，會增加Ｋｍ值，可以用公式３來表示。

非競爭性抑制比較少見，是抑制劑與底物可逆性地結(jié)合，對Ｋｍ不產(chǎn)生影響，會降低Ｖｍａｘ，通常認(rèn)為混合抑制的初期表現(xiàn)為此抑制現(xiàn)象。

反競爭性抑制是抑制劑只與酶－底物復(fù)合物結(jié)合，而不與游離酶結(jié)合，使得Ｋｍ和Ｖｍａｘ都變小，但Ｖｍａｘ／Ｋｍ比值不變，可以用公式４來表示。

此外，還有混合抑制（ＭｉｘｅｄＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），表現(xiàn)為Ｖｍａｘ降低，Ｋｍ增高，由于多種結(jié)合機制造成，抑制劑可與底物競爭游離酶的結(jié)合部位，抑制劑先結(jié)合酶分子再與底物結(jié)合，抑制劑還可結(jié)合酶－底物復(fù)合物。

ＩＣ５０和Ｋｉ通常用來表示一個化合物的抑制能力，但兩者不等同。

Ｋｉ＝ ［Ｅ］［Ｉ］／ ［ＥＩ］，由多個底物濃度（通常３～４種）和多個抑制劑濃度（通常４～５種）確定；ＩＣ５０是由一個底物濃度和多個抑制劑濃度確定。

ＩＣ５０表示底物代謝被抑制５０％時的抑制劑濃度，Ｋｉ是酶－抑制劑復(fù)合物的解離常數(shù)。

ＩＣ５０與底物濃度以及酶濃度相關(guān)，Ｋｉ值與此類因素?zé)o關(guān)，故只有在相同底物濃度和相同酶濃度時ＩＣ５０值才可以相互比較，而不同底物的Ｋｉ值可以相互比較。

此外，當(dāng)?shù)孜餄舛确浅＝咏耍碇禃r，ＩＣ５０／２等于Ｋｉ。

3確定受試藥物的代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物

代謝途徑鑒定實驗，是將藥物和不同種系（匯智泰康不同種系肝微粒體，大鼠肝微粒體，比格犬肝微粒體，小鼠人肝微粒體，人肝微粒體等）的混合肝微粒體一起孵育，或用肝細(xì)胞或者肝臟部分組織培養(yǎng)藥物，然后通過HPLC-MS/MS分析孵育介質(zhì)或培養(yǎng)基和細(xì)胞內(nèi)容物，可以大致確定該藥物是否是肝微粒體P450酶的底物，可以直接獲得氧化、水解或基團轉(zhuǎn)移形成的代謝物，提供平行代謝還是先后代謝的信息，以及主要代謝途徑和代謝產(chǎn)物可能存在的種屬差異。

此項分析需要借助代謝物譜預(yù)測篩查軟件進行。

4藥物代謝酶的確認(rèn)并注意CYP酶的種屬差異

如果CYP酶對藥物的代謝量大于藥物總清除率的２５％，則應(yīng)當(dāng)進行CYP酶鑒定研究，也稱為反應(yīng)表型研究［１１］。

利用下述３種方法確認(rèn)不同的CYP酶對藥物代謝的貢獻。

4.1 計算機輔助設(shè)計對接預(yù)測

根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ）提供的信息得到CYP450酶亞型的晶體結(jié)構(gòu)。

藥物－CYP450蛋白空間模擬對接時，主要基于空間位置上鄰近CYP450蛋白中血紅素和鐵氧離子的底物識別位點而進行。

運用軟件的對接程序，通過漸進式構(gòu)造算法來計算優(yōu)化配基與底物識別位點間的相互作用，通過氫鍵和疏水作用的加合來計算自由能，進而利用軟件的評分功能將計算所得的自由能數(shù)值求和后按照從小到大的順序排序。

4.2 特定的化學(xué)物質(zhì)或抗體作為特異性酶抑制劑

大部分化學(xué)抑制劑對各個CYP酶均無特異性，表２列出了實驗可選用的特異性化學(xué)抑制劑［１２］。

藥物的濃度要≤ Ｋｍ值，盡可能在初始比率條件下（代謝產(chǎn)物產(chǎn)生速率與時間和酶濃度呈線性）進行實驗。

抑制劑均用甲醇溶解，采用一系列濃度。

當(dāng)使用基于作用機制的抑制劑（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－ＢａｓｅｄＩｎｈｉｂｉｔｏｒ）時，將抑制劑與酶預(yù)先孵育１５～３０ｍｉｎ。同時，還應(yīng)注意同一抑制劑對不同種屬同一CYP酶的靈敏度不同。

選擇足夠低和足夠高的抗體濃度來對抑制抗體的抑制作用進行試驗，以確定滴度曲線。

4.3 應(yīng)用不同的重組CYP酶

這種技術(shù)對研究單個CYP酶在整個藥物代謝中的相對貢獻的大小具有很高的價值，但不能代表人肝微粒體在體外的代謝比率。

重組酶孵育體系與肝微粒體相似，除CYP2A6和CYP2C9的反應(yīng)介質(zhì)為Ｔｒｉｓ緩沖液（PＨ７．５）外，其他酶的介質(zhì)均為磷酸鉀緩沖液（PＨ７．４）。

5確定受試藥物是否是肝微粒體P450酶的抑制劑

5.1 實驗設(shè)計注意事項

（１）將藥物與合適的探針底物［１２］ （見表３）和相應(yīng)的CYP450酶共培養(yǎng)。

（２）測定ＩＣ５０時，在底物代謝率允許的情況下，盡量使底物濃度低于Ｋｍ值，使ＩＣ５０與Ｋｉ值更具相關(guān)性。

（３）肝微粒體蛋白濃度通常＜１ｍｇ·ｍＬ－１。

（４）緩沖液的性質(zhì)、PＨ 對Ｖｍａｘ和Ｋｍ會有影響，盡可能采用標(biāo)準(zhǔn)化分析條件。

（５）反應(yīng)系統(tǒng)中控制底物或抑制劑的消耗不超過１０％～３０％，但是對于Ｋｍ值很低的藥物來說，控制反應(yīng)體系底物消耗＜１０％很困難。

（６）建議時間－產(chǎn)物形成量呈線性關(guān)系。

（７）建議酶量－產(chǎn)物形成量呈線性關(guān)系。

（８）所有溶劑的濃度都要＜１％ （ｖ／ｖ），-好＜０．１％，同時設(shè)立無溶劑對照。

（９）實驗設(shè)立一個已知抑制劑的陽性對照（見“４．２”項下）。

（１０）結(jié)果分析，確定受試藥物是否是可逆性抑制劑，是否是基于作用機制抑制劑［１１］。

5.2 確定受試藥物是否是可逆性抑制劑

理論上，抑制劑在作用部位的濃度與底物的Ｋｉ值相當(dāng)或超過Ｋｉ時會產(chǎn)生明顯的抑制效應(yīng)。相互作用程度（以Ｒ表示，代表底物ＡＵＣ改變的倍數(shù)）可以通過Ｒ＝１＋ ［Ｉ］／Ｋｉ進行評估，［Ｉ］是酶活性部位暴露的抑制劑濃度，代表了給予-高推薦臨床劑量后，所有藥物（結(jié)合和未結(jié)合）的平均穩(wěn)態(tài)Ｃｍａｘ值；Ｋｉ是抑制常數(shù)。

目前推薦根據(jù)［Ｉ］／Ｋｉ可以預(yù)測體內(nèi)相互作用的可能性，比值升高，產(chǎn)生相互作用的可能性增大［１３］，見表４。

盡管通過體外數(shù)據(jù)定量預(yù)測體內(nèi)相互作用發(fā)生的可能性存在困難，但可以通過同一個藥物對不同CYP 酶（CYP1A2， CYP2C8， CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6和CYP3A）的［Ｉ］／Ｋｉ值進行篩選排序。

采用大［Ｉ］／Ｋｉ比值的CYP開展體內(nèi)研究，如果該CYP顯示無體內(nèi)相互作用，則無需進行其他CYP體內(nèi)評價研究。

對于CYP3A的抑制劑，建議評價２個結(jié)構(gòu)不相關(guān)的底物，如果其中一個顯示有潛在相互作用，則應(yīng)進行體內(nèi)評價。

5.3 確定受試藥物是否是基于作用機制抑制劑

體外實驗還應(yīng)進行時間依賴抑制篩查，建議加入底物前，對潛在抑制劑進行３０ｍｉｎ預(yù)培養(yǎng)，起始產(chǎn)物形成率的所有時間依賴性及濃度依賴性損失均表明為作用機制性抑制［１４］。

6

確定受試藥物是否是肝微粒體P450酶的誘導(dǎo)劑

6.1 實驗設(shè)計注意事項

（１）受試藥物的濃度應(yīng)該參考臨床治療劑量的血藥濃度，至少包括３個涵蓋治療窗的篩選濃度，其中至少１個濃度要超過平均預(yù)測血藥濃度１個數(shù)量級。

（２）與完整的單層肝細(xì)胞或分離的微粒體共孵育２～３ｄ后，通過CYP特異的探針底物（見表３），參照“５．１”項實驗條件測定酶活性。

（３）應(yīng)包括一個*的酶誘導(dǎo)劑［１２］ （見表５）作為陽性對照，來減小不同供體酶催化活性差異引起的誤差。

6.2 酶誘導(dǎo)終點預(yù)測

受試藥物體外實驗引起的酶活性的改變≥４０％陽性對照結(jié)果時，可以認(rèn)為藥物具有酶誘導(dǎo)作用，需要進一步的體內(nèi)研究。

根據(jù)目前了解的CYP酶誘導(dǎo)的細(xì)胞學(xué)機制，如果一個誘導(dǎo)實驗顯示CYP3A4酶沒有誘導(dǎo)作用，可以推斷此藥物對CYP2C8，CYP2C9和CYP2C19也沒有誘導(dǎo)作用［１５］。

6.3 其他方法

除直接測定酶活性方法外，還有一些其他的方法確定誘導(dǎo)性。應(yīng)用特異性的多克隆抗體進行ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ對酶進行定量，該方法需要解決電泳技術(shù)對不同CYP酶的*分離問題和抗體對CYP酶的特異性問題。應(yīng)用ＲＴ－PＣＲ 技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)特定酶的ｍＲＮＡ表達水平，但有時ｍＲＮＡ的表達水平與酶活性的關(guān)系不能確定， 但是當(dāng)酶誘導(dǎo)作用（ｍＲＮＡ水平上調(diào)）和酶抑制作用（酶活性下調(diào)）同時存在時，ｍＲＮＡ的測定是有益的。對于受體介導(dǎo)的CYP酶誘導(dǎo)作用可以采用受體基因測定的方法，細(xì)胞表面受體介導(dǎo)的CYP1A，CYP2B和CYP3A 酶誘導(dǎo)作用已經(jīng)被確認(rèn)，已經(jīng)開發(fā)了高通量ＡｈＧ （芳烴受體）和PＸＲ （孕甾烷Ｘ受體）結(jié)合測定和細(xì)胞受體基因測定法，并用于篩選具有CYP1A和CYP3A誘導(dǎo)可能性的化合物。

參考文獻

文章來源：中國藥事２０１３年第２７卷第１期

北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司是一家位于中美兩地的生物醫(yī)藥合同研發(fā)機構(gòu)，整合中美兩地的藥物研發(fā)技術(shù)服務(wù)平臺，基于AAALAC、GLP、ISO/IEC 17025實驗室認(rèn)證，面向企業(yè)及研發(fā)機構(gòu)提供分析化學(xué)、DMPK、藥理藥效、生物學(xué)、以及毒理安全性評價產(chǎn)品與服務(wù)。
主要產(chǎn)品：
體外藥物代謝產(chǎn)品
Ⅰ相代謝穩(wěn)定性試劑盒
Ⅱ相代謝穩(wěn)定性試劑盒
CYP450酶代謝表型研究試劑盒
不同種屬肝微粒體，肝S9
CYP450酶，標(biāo)準(zhǔn)品，孵育系統(tǒng)等

遺傳毒性產(chǎn)品
Ames試劑盒
體外染色體畸變試驗試劑盒
TK基因突變試驗試劑盒
HPGRT基因突變試劑盒
彗星試驗試劑盒
誘導(dǎo)大鼠肝S9等

空白生物基質(zhì)
空白血清：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白血漿：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白血：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠，豬，兔
空白尿液：食蟹猴，恒河猴，比格犬，大鼠，小鼠